Hepburn je slovila za skromnu, dragu i šarmantnu osobu, kojoj su uvijek drugi bili na prvom mjestu. To je posebno pokazala kad se već bližio kraj njezinog života svojim radom za UNICEF kao veleposlanica dobre volje.
Glumom se prvenstveno počela baviti zbog zarade kojom je pomagala svojoj majci. Njezina prva velika uloga bila je u filmu iz 1951. - "The Secret People" u kojem je glumila balerinu. Audrey je plesala balet od djetinjstva i dobila je pohvale za svoj talent kojeg je i pokazala u filmu, ali njezini su je učitelji proglasili previsokom za profesionalno bavljenje baletom. Odabrana je za igranje naslovne uloge u Broadwayskoj glazbenoj komediji Gigi koja je premijerno prikazana 24. studenog 1951. Za svoju je debitantsku ulogu dobila nagradu "Theatre World Award".
Zatim joj je ponuđena uloga u filmu Praznik u Rimu s Gregoryem Peckom. Za svoju je glumu 1953. godine osvojila Oscara za najbolju glumicu. Godinama kasnije, kad ju je Barbara Walters pitala koji je njezin najdraži film, Hepburn je bez oklijevnja odgovorila - Praznik u Rimu, zato što ju je taj film učinio zvijezdom.
Nakon Praznika u Rimu Hepburn je s Humphreyem Bogartom i Williamom Holdenom snimila Sabrinu, a s Holdenom je imala i kratku romansu. Mnogi misle da je Holden smatrao Audrey ljubavi svog života. Godine 1954. Audrey je glumila u predstavi Ondine s Melom Ferrerom, za kojeg se udala kasnije te godine. Za glumu u Ondine dobila je nagradu Tony za najbolju glumicu koja je došla samo šest tjedana nakon Oscara za Praznik u Rimu i Hepburn je tako potvrdila svoj ugled kvalitetne filmske i kazališne glumice.
Hepburn se profilirala kao jedna od najpopularnijih glumica Hollywooda. Marilyn Monroe nije bila jedina koja je predsjedniku Johnu F. Kennedyju pjevala "Happy Birthday, Mr. President" za njegov rođendan. Za Kennedyjev sljedeći (i posljednji) rođendan, 29. svibnja 1963., Hepburn, predsjednikova najdraža glumica, pjevala mu je "Happy Birthday, dear Jack".
Postavši jednom od najpopularnijih hollywoodskih atrakcija, Audrey Hepburn je glumila u filmovima s drugim velikim glumcima kao što su Fred Astaire u Smiješnom licu, Humphrey Bogart i Gary Cooper u Ljubavi poslijepodne, George Peppard u Doručku kod Tiffanyja, Cary Grant u Charadeu, Rex Harrison u My Fair Lady, Peter O'Toole u Kako ukrasti milijun i Sean Connery u Robin i Marian. Mnogi su se od tih glumaca zbližili s njom. Rex Harrison je Audrey zvao svojom najdražom glavnom glumicom; Cary Grant je jednom rekao da "sve što želi za Božić je snimiti još jedan film s Audrey Hepburn", a s Gregoryem Peckom je ostala prijateljica cijelog života. Nakon njezine smrti Peck je pred kamerom recitirao njezinu najdražu pjesmu, "Unending Love" (Ljubav koja ne prestaje).
Holly Golightly, koju Hepburn glumi u Doručku kod Tiffanya postala je jedna od najvećih filmskih ikona 20. stoljeća, a s njom se može mjeriti i uloga Elize Doolittle u My Fair Lady. Od 1967., nakon petnaest uspješnih godina u filmskom svijetu, Hepburn je samo povremeno glumila. Nakon razvoda od prvog supruga Mela Ferrera, udala se za talijanskog psihijatra Dr. Andrea Dottia s kojim je dobila drugog sina. Nakon razvoda od Dottia pokušala se 1976. vratiti na filmsko platno ulogom u Robin i Marian sa Seanom Conneryem. Film je bio uspješan, ali nije odgovarao već uobičajenim standardima hit-filmova Audrey Hepburn. Na veliko iznenađenje svih, odbila je ulogu bivše balerine u filmu "The Turning Point" (Ulogu je dobila Shirley MacLaine i to je bio film koji ju je proslavio). Hepburn je kasnije izjavila da najviše žali zbog odbijanja te uloge. Ponovno se vratila 1979. u filmu Bloodline (Krvna linija), ali taj film nije dobro prošao ni kod kritičara ni kod publike.
Jedna od posljednjih uloga Audrey Hepburn bila je u modernoj komediji They All Laughed (Svi su se smijali) u kojoj je glumila s Benom Gazzarom. Redatelj filma bio je Peter Bogdanovich. Kritičari su pohvalili film, ali on je ostao u sjeni brutalnog ubojstva jedne od glumica, Bogdanovicheve djevojke, Dorothy Stratten. Film je počeo s prikazivanjem nakon njezinog ubojstva i nije bio veliki hit.
Nakon svojeg posljednjeg filma proglašena je posebnom veleposlanicom UNICEF-a. Zbog svojih je iskustava tijekom 2. svjetskog rata odlučila ostatak svog života posvetiti pomaganju djeci iz najsiromašnijih zemalja.
Iako je za UNICEF radila i tijekom 1950ih sada se puno više posvetila tom radu. Posjećivala je zemlje u Africi i južnoj Aziji. Željela je i sama pomoći, ali i proširiti svijest o uvjetima u kojima ti narodi žive. Neumorno je radila za UNICEF čak i u posljednjim mjesecima svog života.
Za svoj je humanitarni rad dobila i nagrade, između ostalog i Medalju slobode koju joj je 1992. uručio američki predsjednik George Bush.
Godine 1992. je Hepburn počela osjećati bol u trbuhu za koju se ispostavilo da je posljedica rijetke vrste raka slijepog crijeva. Operirana je u Los Angeleskoj bolnici, ali rak se nastavio širiti, a ona je odbila kemoterapiju. Hepburn je preminula 20. siječnja 1993. u Tolochenazu u Švicarskoj. Ipak, ostala je zapamćena kao jedna od najljepših glumica koja se ikad pojavila na filmu.
